Kultur Jaringan Tanaman

Penggunaan tehnik KJT dapat memperoleh:

1. Metaboit sekunder yang identik atau beberapa dgn metabolit sekunder tanaman asal.
2. Kadang-kadang tidak mampu menghasilkan senyawa yang spesifik dari tanaman asal.
3. Kadar yang dhasilkan dapat sama,lebih besar ataupun lebih kecil dari kadar tanaman asalnya.

Metabolit sekunder adalah hasil dari metabolisme yang panjang, metabolit ini dihasilkan jika metabolit primer terpenuhi.

Salah satu syarat keberhasilan tanaman pada KJT adalah:

1. Pemilihan media baik komposisi maupun jumlahx.

2. Apabila media yang dipakai sesuai,jaringan yang ditanam akan tumbuh berkembang membentuk kalus.

Kalus adalah massa sel yang tak terdiferensiasi, terdiri dari sel parenkim yang muncul dari sel jaringan induk yang sedang membelah dan biasanya terjadi ditempat irisan untuk menutupi luka dalam media.

Beberapa senyawa yang sudah berhasil diproduksi dalam KJT:

1. Sitokinin (Lithospermum erythrorizan)
2. Antrakinon (Morinda citrifolia)
3. Diosgenin (Dioscorea deltoidea)
4. Asam rosmarinat (Coleus blumei)
5. Reserpina (Catharanthus roseus/tapak darah)
6. Atropine (Coptis japanicum)
7. Capsaicin (Capsicum frutescens)
8. Artemisinin (Artemisia annua/anti malaria)

Tehnik Kultur Jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma sel, sekelompok sel, jaringan dan organ serta menumbuhkan dalam kondisi aseptik sehingga dapat memperbanyak diri dan beregenerasi jadi tanaman utuh.

Kegiatan KJT

1. Persiapan : Media,bahan tanaman.
2. Isolasi dan penanaman.
3. Inkubasi dan penyimpanan kultur.

Laboratorium KJT

1. Pertumbuhan eksplan atau inokulum, diusahakan dalam lingkungan aseptik dan terkendali.
2. Pembagian ruangan yang tepat.
3. Mempunyai udara yang bersih,tidak banyak debu dan polutan.

Pembagian ruangan KJT

1. Ruang persiapan

2. Ruang transfer

3. Ruang kultur = ruang inkubasi

4. Ruang stok

5. Ruang mikroskop/ruang analisis.

Ruang Persiapan

1. Untuk mempersiapkan media kultur dan bahan tanaman: Penimbangan, pengenceran, penuangan kedalam wadah kultur dan sterilisasi (harus ada lemari, timbangan dan autoklaf ).

2. Sebagai tempat pencucian : Kotoran bahan dan dari lapangan, pembuangan dan pemotongan bagian yang tidak diperlukan dan perlakuan awal menghindari sumber kontaminasi.

3. Tempat penyimpanan alat-alat gelas.

Peralatan

1. Timbangan analitik : ketelitian 0,1 mg dan 1 g .

- Sensifitasnya.

- Ketelitiannya.

- Jumlah yang dapat ditimbang.

2. Lemari es : larutan stok, vitamin dan hormon.

3. Hot plate dan magnetik stirrer

4. Bunsen

5. Microwave oven

6. Pengukuran ph : kertas indicator, ph-meter, ph elektronik paper.

7. Agar dispenser

8. Oven

9. Autoklaf

10. Alat”gelas : Abu takar, pipet, mikropipet, erlenmenyer, gelas piala, petridish, wadah kultur, pengaduk gelas.

11. Alat”kecil : Spatula, scalpel, pinset, pisau .

12. Sentrifus

13. Alat”u/mencuci

14. Rak pengering

15. Lemari : alat, bahan kimia, bahan lain.

16. Lemari asam

17. Hood : tempat penimbangan bahan karsinogenik.

18. Kereta dorong.

Melalui kultur jaringan dapat dilakukan

1.Manipulasi jumlah kromosom melalui bahan kimia atau meregenerasikan jaringan tertentu dalam tanaman.

2.Tanaman haploid dan double haploid yg homogeneos melalui mikrospora.

3.Polinasi in vitro dan pertumbuhan embrio dan secara normal abortif.

4.Hibridisasi somatik melalui tehnik fusi protoplasma baik intraspesifik maupun interspesifik.

5.Variasi somaklonal

6.Transfer DNA atau organel untuk memperoleh sifat tertentu.

Pembagian kultur

1. Kultur organ → Diinisiasi dari bagian tanaman seperti ujung akar, pucuk aksilar, ujung pucuk, (meristem) dan biji (embrio).

2. Kultur kalus → Sekumpulan sel yang tak terorganisir, hanya sel parenkim, tak terdiferensiasi

3. Kultur protoplasma → Selx mudah diinisiasi dalam media cair kemudian dihilangkan dinding selnya dengan menggunakan enzim. protoplasma kemudian dibiarkan membelah diri dan membentuk dinding kembali pada media padat .

4. Kultur haploid → Kultur yang berasal dari bagian reproduktif tanaman yaitu kepala sari (k.anther) atau tepung sari (k.mikrospora).

Ruang transfer dimana pekerjaan aseptic dimulai

1. Dalam ruangan ini diakukan kegiatan isolasi bag.tanaman, sterilisasi, dan penanaman eksplan dalam media .

2. Ruangan ini sedapat mungkin bebas debu dan serangga serta ruangan ini tersekat.

3. Pintu penghubung harus selalu tertutup, ber AC dan punya pintu penghubung dengan ruangan stok, r.mikroskop, dan r.kultur.

Alat yang digunakan pada runag transfer:

1.laminar air flow cabinet / transfer box.

2.dissecting microscop

3.cart selalu disemprot pakai alcohol 70%

4.alat” diseksi : scalpel, pinset, spatula, gunting, dan jarum.

5.filter milipor

6.hand sprayer u/ alcohol

7.Bunsen burner / lampu alcohol.

8.timbangan digital dan chamber electrofusion.

Ruang kultur

1.pertambahan kultur terjadi secara periodik disebabkan pertumbuhan satu jenis atau penambahan jenis kultur baru.

2.kultur yang telah tumbuh dan telah memperbanyak diri secara teratur harus disubkulturkan setiap 4-6 minggu sekali.

3.eksplan memang sudah dipenuhi. kebutuhan karbohidratnya dari gula dan media.

Unsur dari cahaya yang perlu diperhatikan:

1. kwalitas cahaya, cahaya putih merupakan cahaya yang baik untuk pertumbuhan kultur. Lampu fluorescent, sangat baik digunakan dan sangat efisien dalam penggunaan energi dibandingkan dengan lampu pijar.

Tehnik Aseptik

1.keberhasilan kultur jaringan adalah menghindari kontaminasi yang dapat terjadi pada setiap saat dalam masa kultur.

Sumber kontaminasi berasal

1 eksplan → eksternal dan internal.

2 Organisme kecil yang masuk kedalam media, spt semut.

3 Bobot kultur atau alat2 tanam

4 Lingkungan kerja dan ruang kultur (spora diudara)

5 Kecerobohan dalam pelaksanaan.

Prosedur aseptic meliputi:

1.sterilsasi lingkungan kerja.

2.sterilisasi alat2.

Sterilisasi lingkungan kerja

Lingkungan umum (r.transfer)

1.membatasi personil

2.membersihkan ruangan (desinfektan, karbol, clorose)

3.memakai alas kaki dan jas lab.khusus u/ didalam ruangan.

4.penanaman eksplan dan prosedur lain seperti isolasi protoplasma, dilakukan dalam transfer box.

Lingkungan spesifik(transfer box )sekarang laminar air flow cabinet.

1. sebelum mulai kerja.

Permukaan dilab.dengan alcohol 70 %, lampu UV dinyalakan ½-1 jam.

2. setelah kerja prosesnya sama.

Sterilisasi alat dan media

1. Alat yang dipakai ketika penanaman harus dalam keadaan steril: pembakaran(pinset, gunting, scalpel), autoclave (media, aquadest, alat2, kertas saring), oven (botol2, t.reaksi, erlenmenyer) 4 jam 160⁰C.

Sterilisasi Bahan Tanaman

1. harus bebas kontaminasi, selain debu dan kotoran ada kontaminan hidup (cendawan, bakteri, tungau, dan spora)ada yang kontaminan internal yang berasal dari jaringan tanaman (bakteri) sangat sulit diatasi, harus diberi perlakuan antibiotic atau fungisida.

Tingkat kontaminasi permukaan pada tanaman tergantung pada :

1.	Jenis tanaman	Sukar u/ menentukan prosedur sterilisasi standart yg berlaku u/ smua tan.
2.	Bagian tanaman yang digunakan	Jga u/ menentukan prosedur standart pada satu jenis tan.dari tempat yang berbeda
3.	Morfologi permukaan (b’buku, berduri atau tidak)	Prosedur sterilisasi setiap bahan tan.harus dilakkn melalui percobaan pendahuluan.
4.	Lingkungan tumbuhan (green house / lapangan)	Proses sterilisasi bahan tan. Harus dilakukan dlm beberp tahap.
5.	Waktu pengambilan(m.hujan /kemarau)
6.	Umur tanaman
7.	Kondisi tanaman

Jenis bahan sterilisasi tanaman.

Bahan	konsentrasi	waktu
Ca.hipoklorid	1-10 %	5-30’
Na.hipoklorid	1-2 %	7-15’
Hydrogen peroksid	10-12 %	5-15’
Perak nitrat	1 %	5-30’
Merkuri klorid	0,1-0,2 %	10-20’
Betadin	2,5-10 %	5-10’
Fungisida	29 %	20-30’
Antibiotic	50 mg/l	30-60’
alkohol	70 %	½-1’

Prosedur sterilisasi bahan dapat dimodifikasi sebagai berikut:

1.fungisida / ab – merkuri klorid – aquadest steril.

2. alcohol - sodium hipoklorid – merkuri klorid – aquadert steril.

3. alcohol – sodium klorid – betadin – aquadest steril .

Untuk menghindari pemborosan media perlakuan maka :

1. Eksplan tidak langsung ditanam didalam media perlakuan, tetapi pada media preconditioning ( media dasar tanpa hormon) u/ menguji efektifitas sterilisasi.

2. Selama 3-7 hari pada media preconditioning dan tidak menunjukkan adanya gejala kontaminasi, eksplan siap kemedia perlakuan yang sesungguhnya.

3. Eksplan yang tak terkontaminasi dibuang.

Cara sterilisasi organ/ eksplan dgn bahan kimia.

1. Ambil organ yang akan dijadikan eksplan.cuci sampai bersih dgn air (2-3X) letakkan dalam petridisk atau erlenmenyer.

2. Timbang zat kimia u/ sterilisasi larutkan dalam aquadest sesuai dengan kebutuhan.

3. Selanjutnya kedua bahan tersebut dimasukkan kedalam lamina air flow yang sudah dibasahi dengan alcohol atau spiritus.

4. Masukkan potongan organ / eksplan yang akan disterilsasi kepetri / erlenmenyer digocok secara perlahan agar eksplan terbasasi secar sempurna.

5. Apabila eksplan masih mengandung daun pembungkus, sisik, bulu, duri, ataupun bahan lain maka harus dibersihkan sampai yang mudah yang berwarna tampak keputihan.

6. Cuci eksplan dengan aquadest steril 2-3 kali kemudian dipotong kecil2 dengan ukuran 1-5 mm ekspan siap tabur .